 | 「脳を知る」平成11年度採択研究代表者
「学習·記憶のシナプス前性メカニズムの解明」
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| | | | Abstract: 学習·記憶や回路形成のメカニズムとしてシナプス前終末の可塑性が普遍的に重要だが、その誘導·発現·維持のメカニズムの詳細は不明である。シナプス前終末の構造的な変化を伴わない機能的可塑性と構造的可塑性の2つの要素から成り立つのか?各々のシナプスの伝達効率が亢進するのか、それとも伝達物質放出能を持たないシナプス(muteシナプス)が新たに賦活化されるのだろうか?機能的可塑性がどの開口放出素過程の修飾により引き起こされるのか、そのとき、シナプス前終末においてどのような生化学反応が引き起こされているのか?タンパク質リン酸化が関与しているならば、それが可塑性を説明するのか?数多くの未解決の問題がある。本研究においては、海馬苔状線維シナプス前終末、培養海馬ニューロンシナプス、PC12細胞などをモデルシステムとして、シナプス前終末可塑性の誘導·発現·維持のメカニズムを素過程·分子レベルで解明することを目的とする。シナプス前終末の微小性、ヘテロ性、生化学的複雑性などに由来する困難を、GFP誘導体リコンビナントプローブ、新しいプローブ導入法などの新しい生理学的研究法を開発することによってブレークスルーする。平成11年度の研究で、細胞内Ca2+をレポートするGFP誘導リコンビナントプローブを改良した。また、ウィルスを用いたトランスフェクション法によりGFP誘導リコンビナントプローブをシナプス前終末に導入する目的で、マウス海馬スライス培養系と海馬歯状回顆粒細胞培養系を立ち上げた。現在、GAD67遺伝子にGFPをノックインしたマウスの作製に取りかかっている。これにより、GABAニューロンを特異的にラベルすることを試みる。海馬歯状回ニューロンオータプスを用いて、cAMPPKA系活性化により促進される開口放出素過程を同定した。発達期ラット小脳においてシナプス前性ニューロンからの伝達がニコチン性アセチルコリン受容体依存的に促進されるメカニズムを解析した。PC12細胞においては、PKA依存的に伝達物質放出が促進される。PKAがrabphilin-3AのSer234をリン酸化することを明らかにしたが、rabphilin-3Aを発現しないサブクローン細胞においてもPKA依存的に伝達物質放出の促進が認められた。ウィルスを用いたトランスフェクションシステムのセットアップは平成11年度に終了した。細胞内Ca2+をレポートするGFP誘導リコンビナントプローブを組み込んだウィルスを歯状回顆粒細胞にトランスフェクションし、シナプス前終末に発現させる計画にとりかかっている。この経験をふまえて、微小環境pHの5から7.4の変化にダイナミックに応答する改変GFPを開発し、これをシナプトタグミンのN-末にリンクさせたプローブを作製し、トランスフェクション法により苔状線維シナプス前終末シナプス小胞に発現させる計画にとりかかる。シナプス小胞内pHを蛍光測定することにより、開口放出を定量化するのだが、これに必要なマルチフォトン顕微鏡システムのたち上げは、平成11年度に終了した。さらに機能プローブを組み込んだトランスジェニック動物やノックイン動物の作製を試みる。シナプス前終末内Ca2+と開口放出を単一シナプスレベルで測定することにより、cAMP-PKA系活性化に対する応答のヘテロ性を解析するとともに、muteシナプス仮説を検証する。muteシナプスの賦活化が認められたならば、これを顕微鏡下に固定し、rabphilin-3Aの抗リン酸化部位抗体と反応させる。muteシナプスの賦活化に並行して、rabphilin-3Aのリン酸が認められるかを検討する。 |
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